当前位置:首页 > 文章资讯 > 农林牧渔 > 农林牧渔-兽医学:非洲猪瘟的实验室诊断技术
农林牧渔-兽医学:非洲猪瘟的实验室诊断技术
本着接地气的原则,笔者尝试着对非洲猪瘟的实验室诊断技术,主要是荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附技术,展开分析讨论,供ASF防控参与者一同交流。商品化试剂盒常常做为技术的载体出现,这里不做任何厂家试剂盒的广告,仅从技术角度分析讨论。在讨论诊断技术之前,笔者提出ASF商品化试剂盒的选择原则。
1、试剂盒选择原则
01、敏感性比特异性更重要
去年8月3日沈阳非洲猪瘟疫情确诊之前,我国并不是ASF疫区,根除非洲猪瘟病毒的过程中,诊断技术敏感性与特异性不能兼顾的情况下,敏感性比特异性显得更加重要。用ELISA方法检测ASFV抗体时,间接ELISA较阻断ELISA的敏感性有优势。OIE官方建立的方法,也是间接ELISA(OIE Terrestrial Manual 2012; Chapter 2.8.1)。有条件的话,可以采用间接ELISA筛选,阻断ELISA复核。
2、假阴性比假阳性危害更大
得到非洲猪瘟的实验室检测结果后,阳性结果必然一下子戳中神经,震撼不已,对于阳性结果必然会进行复核。倘若是假阳性,便是虚惊一场。反而阴性结果常常直接略过,不被重视,若此结果是假阴性,那后果将是灾难性的。
|
真实阳性 |
真实阴性 |
检测阳性 |
√√√ |
× |
检测阴性 |
××× |
√ |
3、经过验证的商品化试剂盒才可信
qPCR和ELISA是非常成熟的技术,商品化试剂盒的方法建立难度不大,而用大量临床样品、田间样品和标准品对商品化试剂盒验证与质控的过程,能够体现出严谨的科学态度。国内首发非洲猪瘟疫情之前并非疫区,无法收集到阳性样品,自主研发的商品化试剂盒的验证存在现实困难。不过日前农业部公布的两批非瘟试剂盒应该经过了验证,实验室可以放心使用。重磅!肇庆大华农通过第二次非洲猪瘟现场快速检测试剂评价
2、荧光定量PCR
笔者认为选择经OIE参考室验证的商品化试剂盒用于ASF监测排查,尽快掌握国内ASF疫情,快速处置,对ASF根除是有利的。部分商品化试剂盒在欧非等传统ASF疫区普遍使用,产品成熟而可靠。
若采取统一“度量衡”,以便于全国检测结果数据的横向比对。采用OIE推荐的非洲猪瘟病毒扩增p72基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U),开展监测排查具有现实可行性。导致检测结果出现假阳性和假阴性结果的因素很多,假阳性的原因自查后会发现,而如何避免假阴性结果的出现,是在检测工作开始之前需要认真考虑的事情。qPCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量,除了引物以外,还需要提取试剂、预混液、对照试剂等。
笔者在这里提出几点建议:
1、提供有效的检测样品是前提
《非洲猪瘟现场排查手册》对样品的采集、包装与运输做出了详细说明,推荐使用“三重包装系统”,运送的样品必须附有做够的冷却材料(如冰袋),以防变质。确保送达实验室的待测样品是有效的,是开展检测工作的前提。实际基层采样工作中,低温保存和运输是存在现实困难的。在这一方面OIE参考实验室德国FLI实验室(Friedrich-Loeffler-Institute)做了很好的尝试,采用GenoTube拭子采样管做为采样工具,常温运输和保存送达实验室,开展qPCR核酸检测,ELISA和胶体金检测卡抗体检测。更欣喜的是FLI对非洲猪瘟的样品采集进行了验证。
2、建立更严谨而合理的检测体系 设立内部阳性对照(IPC) 有效预防假阴性结果出现
国内兽医实验室qPCR检测中会设立阴性对照和外部阳性对照,但却很少设立内部阳性对照(IPC)。Xeno IPC其实就是与所有物种基因组无交叉的核酸序列,被检测样品结果阴性,Xeno IPC检测结果阳性(Ct值预期范围是已知),有效证明无qPCR抑制剂存在,从而降低了假阴性结果的风险,对ASF这类重大动物疫病监测具有重要的意义。美国兽医实验诊断协会(AAVLD)在实验室指南中明确推荐Xeno IPC在qPCR检测过程中使用。
3、选择高品质的核酸提取试剂和预混液
PCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量。核酸提取试剂盒必须是通用型样品制备试剂盒,可满足实验室对多种样品类型检测需求,并对全血、脾脏、淋巴结、扁桃体和环境样品等进行过验证。模块化技术经过专门优化,能够从最广泛的样品类型之中纯化核酸,具有高简便性、性能一致性并节省时间和成本,从而帮助提高实验室的效率。预混液要求对酶进行优化,以帮助鉴定那些最重要的动物病原体靶标,严格开发的试剂稳定且一致,即使用于最具挑战性的动物样品,在PCR抑制剂存在的条件下也依然有效。简单易用的预混液都能帮助获得值得信赖的结果。
4、环境样品的检测结果反应生物安全防护措施是否得当
做好生物安全防护措施才能有效预防非洲猪瘟的传入已成为共识,问题来了,如何证明生物安全防护措施是否得当?构建完善的生物安全监控网络,有计划的采集动物体和环境样品进行qPCR检测,通过客观数据足以量化生物安全措施的防护程度。尤其是针对猪场交叉区域的出猪台、卖猪车、无害化处理车、员工澡堂地面等区域环境样品的检测。
3、ELISA检测技术
在《我国首例非洲猪瘟的确诊》(王清华等)中指出,在非洲猪瘟确诊的辽宁省沈阳市沈北区采集的2头病死猪及同群30 头临床健康猪血清,“对32 份血清样品的ASFV 特异性抗体检测结果均为阴性。” 通常感染了强毒力ASFV的猪只不产生抗体,感染了低致病力或非致死性毒株的猪产生高水平的抗体。急性或最急性死亡,病死率几乎100%是目前我国流行的非洲猪瘟疫情的显著特点,感染猪只未产生ASFV抗体已经死亡,因此很多人认为在当前疫情的情况下,开展血清学抗体检测是无意义的,在此笔者尝试着推敲当前疫情下ASFV抗体检测意义。
笔者认为ELISA抗体检测存在以下意义:
1、急性死亡的病例中也可以检出抗体
《OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册》强调:“在呈地方性流行或由低毒力毒株引起的初次爆发的地方,对于新暴发病的调查研究应包括应用ELISA检测血清或组织提取物中的特异性抗体;血清学方法在辅助确定ASF暴发时的作用不可低估,因为在急性死亡的病例中也可以检出抗体。”
2、及时发现新传入毒株或弱毒株 全面揭示ASF疫情状况
我国首例确诊非洲猪瘟病毒株为格鲁吉亚毒株(Georgia 2007),病死率100%,应该属于强毒力毒株。但同时该毒株从东欧传入俄罗斯,又传入远东地区传入中国,相比较而已,弱毒力毒株具有一定的隐蔽性,更有利于其长距离的传播。从这一点上来看,传入我国的ASFV格鲁吉亚毒株可能也具备一定的隐蔽性。另外,已经明确了23种基因型(Boshoof等,2007),报道的来自不同区域的毒株超过58株。其他基因型或毒株并不会静候在国门之外,强弱毒株都有出入的风险存在。
3、及时发现非洲猪瘟病毒变异后引起的猪场感染
1921年非洲猪瘟在肯尼亚第一次报道,家猪的死亡率为100%(Montgomery,1921)。2010年从不同地区和宿主(家猪、疣猪、扁虱)上分离得到的11株非洲和欧洲ASFV分离株,毒力大小各不相同,在基因组水平也呈现显著的遗传差异(De Villlier等,2010)。我国养猪过程中疫苗免疫种类多大剂量,猪体内抗体种类多,存在其他疫病抗体与ASFV交叉反应,以及干扰素等非特异性免疫应答的可能性,这可能导致ASFV感染猪病程增长,甚至产生抗体。若ASF在国内出现大规模流行,也可能出现病毒驯化的情况。较qPCR的抗原检测,ELISA抗体检测能够帮助猪场及时发现非洲猪瘟病毒变异后的感染。
4、及时发现隐性带毒动物
家猪和野猪都是ASFV等天然宿主,其中有三种非洲野猪可以隐性带毒,成为病毒储存器,这三种野猪是疣猪(Phacochoerus aethiopicus)、大林猪(Hylochoerus meinertzhageni)和非洲野猪(Potamochoerus porcus)(De Tray,1957)。我国除了野猪,还有众多的地方猪品种,很有可能存在众多对来势汹汹的ASFV不当回事,隐性带毒的动物存在。这一问题如果不能及时发现,后患无穷。
综上所述,我认为ASFV抗体检测的意义在于:抗体阳性结果具有明确的诊断意义,抗体阴性结果不能说明任何问题,需正确看待。抗体检测在当前会为我们揭示更全面的ASF疫情,在ASF根除过程中帮助我们及时发现疫情的变化。
目前进口的商品化ELISA抗体检测试剂盒并不多,以下品牌的ELISA试剂盒都经欧盟非洲猪瘟参考实验室(同时也是OIE和FAO非洲猪瘟参考实验室)西班牙CISA-INIA实验室验证,可以查询对应的验证结果,可网上自行查询选择。
制造商 |
技术类型 |
包被抗原 |
立陶宛 LT Biotech |
间接ELISA |
p22 |
法国 IDVET |
间接ELISA |
重组蛋白 |
瑞典 SVANOVA |
间接ELISA |
p30 |
西班牙 INGENASA |
阻断ELISA |
p72 |
CISA-INIA指出,在ASF呈地方流行的区域,确诊可疑病例最好用标准的血清学试验(ELISA),结合另一种血清学试验(IFA)或抗原检测试验(FAT)。在有些国家,95%以上的阳性病例用IFA和FAT结合方法鉴定。IFA和FAT技术目前在国内兽医实验室普及度很低,建议多结合qPCR核酸检测结果诊断。(资料来源:兽医兽诊断试剂)
以上就是100唯尔(100vr.com)小编为您介绍的关于非洲猪瘟的知识技巧了,学习以上的农林牧渔-兽医学:非洲猪瘟的实验室诊断技术知识,对于非洲猪瘟的帮助都是非常大的,这也是新手学习农林牧渔所需要注意的地方。如果使用100唯尔还有什么问题可以点击右侧人工服务,我们会有专业的人士来为您解答。
本站在转载文章时均注明来源出处,转载目的在于传递更多信息,未用于商业用途。如因本站的文章、图片等在内容、版权或其它方面存在问题或异议,请与本站联系(电话:0592-5551325,邮箱:help@onesoft.com.cn),本站将作妥善处理。