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人体解剖学：结缔组织到底该怎么染色?结缔组织的染色方法有哪些？

结缔组织在人体内分布很广泛,由它发生的肿瘤和瘤样病变与其它某些组织来源的肿瘸难以鉴别,如纤维瘤,带状瘤,平滑肌瘤和神经纤维瘤相似,用一般染色难以鉴别。所以,须要用特殊染色法来鉴别,才能作出正确的病理诊断。结缔组织的染色方法有哪些？

以下文章来源于聊点学术 ，作者Mark

结缔组织染色概述

组织学上，结缔组织分为3种，包括致密结缔组织、疏松结缔组织以及网状结缔组织。而结缔组织染色法可以很好的显示出各种纤维，如胶原纤维、网状纤维和弹力纤维，以此展现各种组织病变或修复情况。结缔组织染色最经典的方法是Mallory三色法，其它的染色方法基本都是衍生于它。

Q1： 结缔组织三色法染出来到底有啥用？

答：HE无法有效区分胶原纤维，而三色法可将其标记出来，用于病理分析或半定量分析都是可以的。三色法还可以展现各种组织病变或修复情况，如心肌坏死后纤维修复情况;还可以对心内膜弹力纤维增生和心肌纤维化作鉴别诊断。可以为肿瘤相关病变提供病理诊断参考。

Q2： 各种染色方法的最佳适用条件？

答：(1)Mallory三色法：网状纤维、胶原纤维以及碱性物质可被染成深蓝色，而软骨、黏液等被染成浅蓝色;神经胶质、纤维素、肌纤维以及酸性物质被染成粉红色;红细胞、弹力纤维可被染成橘色;最后细胞核被染成黑蓝色。

一般所说的结缔组织是指纤维性结缔组织而言，其结构特点是细胞间质内基质外含有较多的纤维成分，主要是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维，我们仅简述这三种纤维的常见染色方法。

Mallory三色染色法：常用于判定多种组织、器官的病变程度及修复情况，区分肿瘤组织中的纤维成分与平滑肌。

染色步骤：

①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。

②重铬酸钾液10min。

③蒸馏水冲洗2min，蒸馏水2次。

④酸性复红液2min，蒸馏水稍洗。

⑤苯胺蓝液20min，95%乙醇快速分化。

⑥直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

结果判定：胶原和网状纤维呈蓝色。

(2)Van Gieson苦味酸酸性复红法：可以显示组织、器官的损伤、修复及硬化情况，特别是用于鉴别肿瘤组织中的胶原纤维与平滑肌纤维，可为诊断提供重要依据。

染色步骤：

①组织切片按常规脱蜡水洗。

②用Weigert苏木素液染细胞核5~l0 min。

③自来水充分洗涤数分钟。

④用显微镜检查细胞核的着色程度，过深可用0.5%盐酸乙醇分化。

⑤自来水洗至变蓝;用蒸馏水洗。

⑥用Van Gieson液染1~5 min。

⑦倾去染液，直接用95%乙醇分化和脱水。

⑧无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

结果判定： 胶原纤维呈深粉红色，肌纤维、胞浆及红细胞黄色，细胞核呈棕黑色或兰黑色。

(2)Cason三色法：是经Mallory三色法改良而来的混合型染料染色法，可将酸性物质染的更深，且操作相对简便。

(3)Masson三色法：也是概念而来，较适用于上皮、甲状腺、肿瘤以及垂体等。

(4)AZAN三色法：除了标记结缔组织外，还可将染胰岛和腺垂体细胞染色。

(3)网状纤维染色-Wider染色法：可以用来显示病变组织网状支架的破坏情况。特别是在肿瘤病理诊断中，网状纤维染色对于鉴别来源于上皮组织和间叶组织的恶性肿瘤具有重要价值。

染色步骤：

①组织切片脱蜡至水。

10%②磷钼酸，2~5min。蒸馏水冲洗，5min。

1%③硝酸铀，5s。蒸馏水冲洗，10s。

④氧化银溶液，5~10min。

95%⑤乙醇速洗，1~2s。

⑥还原液还原，1~2s。蒸馏水冲洗，2min。

0.2%⑦氯化金调色，2~20s。蒸馏水冲洗，5min。

5%⑧次亚硫酸钠，2min。蒸馏水冲洗，2min。

⑨核固红染细胞核，5~10min。水稍洗。

⑩常规无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。

结果判定：网状纤维呈黑色、细胞核呈红色。

Q3： 想要染出好看的颜色，该怎样选择固定液？

答：Zenker固定液是首先。因为它的穿透性很强，可以很好地固定每一种组织。固定后的组织染色很清晰。但有溶解染色质的缺点。大家可综合考虑。

Q4： 已经用甲醛固定了的组织怎么处理呢？

答：如果组织已经在甲醛中固定过，且制作成石蜡切片。没事，在切片完全脱蜡复水后，再浸入Zenker固定液中一晚上(室温就行)，然后流水漂洗，直到切片上的黄色基本消失即可进行染色。

Q5： 想看看椎间盘退变，怎么染色？

答：诚然HE染色也是可选的，但是Mallory三色法可以很好地观察椎间盘髓核、软骨终板以及纤维环的病理改变。那么Mallory三色法则提供了较好的对比度，在分辨力上具有优势。染法没啥特殊的，就是要记得在固定后脱钙处理(脱钙液：5%甲酸+5%盐酸+75乙醇混合使用，最终PH调成2。2)。

Q6： 神经损伤怎么染色又快又好？

答：常规HE染色不仅耗时，而且神经髓鞘会被溶解。选择Masson染色可以很好地显示神经髓鞘，比较便宜方便。PS：神经组织可用4%甲醛-钙溶液、Zenker固定液、或者Bouin固定液进行固定，可以有效减少神经髓鞘的丢失。Masson染色步骤不细表。

Q7： 腺体、垂体如何染色比较好看？

答：常规HE染色，确实能染，但是效果不是很好，染色后组织结构不清晰。上面提到的AZAN三色法除了标记出结缔组织外，还可将染胰岛和腺垂体等染色。最终效果是肾上腺的球状带被标记为蓝色，毛细血管呈橘黄色，束状带内的脂肪也比较清晰。垂体中嗜酸性细胞呈红色，嗜碱性细胞和结缔组织呈蓝色，血细胞则染成橘黄色。这样看来，整个颜色分辨度还是蛮高的。

Q8： 网状纤维与免疫组化双染-两开花？

答：同一张肿瘤组织切片上同时染出网状纤维和神经胶质纤维GFAP、以及波形蛋白。网状纤维只能被硝酸银染色，可以选择用常规的Gomori染色法。因此整个过程大致要分两部分。

常规脱蜡复水。

第一步是银染，0。5%高锰酸钾2min后去离子水漂洗;

1%草酸漂白1min后再去离子水漂洗;

2.5%铁明矾溶液3min后去离子水漂洗至少2次;氨银溶液20s后快速漂洗，进入1%甲醛中快速还原，然后水洗(配方：3%的氢氧化钠10ml+10%的硝酸银水溶液10ml，+再加几滴氨水);

0.2%氯化金染成金色后漂洗;最后再用5%的硫代硫酸钠中还原，漂洗。第二步是免疫组化染色，无需再进行抗原修复，直接进入3%双氧水孵育5min，然后水洗;再用PBS平衡5min;

5%血清封闭，室温下10-15min就行;分贝滴加相应的一抗4℃过夜(抗体得选好，滴度可适当提高)，PBS漂洗;接着滴加二抗，可37℃半小时，漂洗干净后进行DAB显色反应。最后水洗干净，采用免疫组化专用苏木素染核、分化、反蓝、水洗。

最后就是常规的脱水透明封片了。

PS： 此法整个过程较长，且存在多步氧化、还原及水洗过程，操作要轻柔，不然分分钟脱片，欲哭无泪。但是理解好这里面每一步，那么你的氨银染色技术肯定突飞猛进。事实上，氨银染色技术还可以依靠微波、胰蛋白酶以及改变试剂配方等方法加强染色，这就属于高阶了。

Q9： 同时显示弹力纤维和脂质？

答：搞血管脂质代谢研究的同志可以试试，大原则就是将油红O染色(配方：油红0。2g+70%乙醇400ml充分混匀后静置，使用时也别晃动)与为维多利亚蓝染色相结合。血管组织要用15%中性甲醛充分固定，再作液氮冷冻冰冻切片，厚度为15微米左右，双蒸水轻轻漂洗;再在70%乙醇中小心漂洗2次;进入油红O中染15min，再用70%乙醇洗干净;在维多利亚蓝中染15min左右;在80%乙醇中分化1min;双蒸水2min小心漂洗后洗去组织周围多余水，用甘油胶封片。

PS：维多利亚蓝染色液如果自己配制，真的很繁琐。建议直接买商品。另外染色时，一定要漂浮染色，可别贴着玻片染。

Q10： 弹力纤维+免疫组化=再次开花

答：Gomori染色法可以很好地区分血管内、中、外弹力膜，层次很清晰。然后再加上你想要的免疫组化标记物。这个跟前面刚好反过来了。先常规染免疫组化，再作Gomori染色。免疫组化可以适当地调整：如选择特异性强的一抗，缩短一抗孵育时间至1h，这样就可以在一天内完成了，小编就贴公司名字了。然后就是Gomori染色：上一步结束，切片要漂洗充分并在70%乙醇适当漂洗;接着在醛品红液中染色10-15min左右，用70%乙醇适当漂洗直至不再掉色，然后晾干树胶封片就行。

PS：醛品红配制法：碱性品红0。5g+70%乙醇100ml+浓盐酸1ml+三聚乙醛1ml。碱性品红溶于70%乙醇混匀后，加浓盐酸混匀，再加三聚乙醛混匀，室温静置2天，待醛品红溶液成熟变成深紫色，过滤后4℃冰箱保存。

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