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发酵工艺：发酵灭菌原理及全自动灭菌技术介绍

在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌广泛使用湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。

用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。

一、湿热灭菌相关理论：

1、微生物的死亡速率：对数残留定律

微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，即对数残留定律。

用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡率）与N呈线性关系，即：

积分边界条件：N₀→N_θ；t₀=0

注：

式中，θ：灭菌时间（s）；

K，灭菌速度常数；

N₀：灭菌开始时培养基中杂菌个数（个）；

N：经过灭菌时间θ后残存的活菌数（个），一般取N = 0.001，即1000次灭菌中有1 次失败

关于上述公式几点说明：

（1）K值越大，微生物越易死亡；

（2）一定温度下，K随M种类不同而异。一般来说，细菌营养体、酵母菌、放线菌、病毒及噬菌体对热的抵抗力较弱，而细菌芽孢、霉菌孢子则较强。

（3）随着温度的变化，K有很大变化。温度对K的影响遵循阿仑尼乌斯定律：

A：系数，s-1；

△E：活化能，J/mol；

R：气体常数，8.314 J/(mol·K)；

T：绝对温度。

2、两种常见灭菌方式：分批灭菌和连续灭菌理论时间计算及优劣比较

（1）分批灭菌

分批灭菌通常分为升温、保压和降温三个阶段。

如只考虑保温阶段，以耐热的芽孢杆菌为灭菌对象，发酵罐内装培养基40m³，121℃分批灭菌，初始培养基中含芽孢10⁷个/mL，关于理论灭菌时间T计算可根据公式：

其中A=1.34×10³⁶s^-1，

ΔE=2.844×10⁵J/mol，

则k=0.0281 s^－1；

No=40×10⁶×10⁷=4×10¹⁴个，

Nt=0.001个，则T=24min，

理论上与一般分批灭菌条件121℃灭菌30min相差不大；若考虑升温阶段对灭菌的贡献，初始温度从100℃计算，从保温开始时培养基中活微生物数不是No而是Np，则：

其中Km为100℃至121℃时间内灭菌常数平均值：

k_m＝0.0061s^－1，Np＝2.65×10¹¹个，保温灭菌时间T=19.7min。考虑升温段的灭菌作用后，保温时间比不考虑的减少了18％。因此，发酵罐体积越大，其分批灭菌的升温时间长，就更应考虑升温段的灭菌作用，其保温时间应更短。

（2）连续灭菌

连续灭菌过程中，培养基需要在短时间被加热到灭菌温度（130-140℃），短时间保温（5-8min），快速冷却，进入已灭菌完毕的发酵罐。如忽略升温的灭菌作用，根据公式

得到停留时间T=2.7min。从上述数据得出连续灭菌时间短，培养基中营养物质损耗相对较少，然而连续灭菌对设备要求较高。

二、影响培养基灭菌效果的主要因素

1、培养基成分

培养基中的油脂、糖类和蛋白质通常能够增加微生物的耐热性，使微生物的热致死速率变慢，这主要是因为有机物质会在微生物细胞外形成一层薄膜，阻碍热的传入，因此应提高灭菌温度或延长灭菌时间。相反培养基中高浓度的盐类（如8%以上NaCl溶液）、色素会减弱微生物细胞的耐热性，一般较易灭菌。在固形物含量高的情况下，灭菌温度要高些。

2、培养基的pH值

pH对微生物的耐热性影响很大。在pH6.0-8.0范围内微生物最耐热，pH<6.0时，氢离子极易渗入细胞内，从而改变细胞的生理反应促进其死亡，故pH愈低，灭菌所需的时间愈短。一般微生物生长对培养基的pH都有一定的要求，在不允许调节pH的情况下，就要考虑适当延长灭菌时间或提高灭菌温度。

3、培养基的物理状态

培养基的物理状态对灭菌有极大的影响。固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长，如果100℃时液体培养基的灭菌时间为1h，固体培养基则需要2-3h才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌时，热量传递是由传导作用和对流作用完成的，而固体培养基只有传导作用而没有对流作用。此外，液体培养基中水的传热系数要比固体有机物质大得多。越浓稠的培养基灭菌所需时间越长。

4、泡沫

泡沫中的空气会形成隔热层，使传热困难，对灭菌极为不利。对易产生泡沫的培养基进行灭菌时，可加入少量消泡剂。

5、培养基中的微生物性质与数量

不同成分的培养基中含菌性质与量是不同的。培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中的含菌量远比化工原料的含菌量多，因此灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌和霉菌孢子多的培养基，要适当提高灭菌温度或延长灭菌时间。

6、冷空气排除情况

高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件，而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌物品。降低蒸汽分压使之不能达到应有的温度，如果灭菌器内冷空气排除不彻底，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽的压力，还有空气的分压，罐内的实际温度低于压力表所对应的温度，造成灭菌温度不够，检验灭菌器内空气排除度，可采用多种方法，最好的办法是发酵罐同时装有压力表和温度计。

三、全自动发酵灭菌技术

自动灭菌介绍：

灭菌在发酵过程中是一道必不可少的工序，决定着后续细菌培养的成败，当然，灭菌过程也会对培养基有一定的损伤和破坏作用。一段高质量的灭菌过程，既能够确保灭菌效果（除菌率99.999999%），又能够确保培养基的新鲜度。目前国内传统发酵设备采用人工操作，三路进汽的方式对发酵罐进行实罐灭菌，人为影响不确定因素较大。甚至于出现同样的培养基配方，同样的发酵工艺，发酵收率相差很大。国外目前大都采用智能控制，自动灭菌的方案。能够确保灭菌过程中的培养基的受热和损伤程度一致，设备多冷点监测，可以确保灭菌过程无死角。还可以降低了人工劳动力，减少了人为不确定因素导致灭菌失败的风险。

自动灭菌控制界面由丰泽生物提供

自动灭菌特点：

全自动原位在线灭菌整个过程采用PLC全自动线性控制，其特点如下：

1 温度控制：罐内温度控制精度及灵敏度高，多阶段温度控制可保证升温、恒温及降温分段控制及强大的延时功能，

2 压力控制：高保真的压力模拟曲线控制确保了罐头杀菌过程的补压、反压及特殊产品杀菌的压力控制。

3 操作流畅：发酵控制系统中可存储多个杀菌公式，亦可现场方便地输入新的杀菌公式，适合于不同产品的灭菌。温度实时在线控制及显示可使操作工及时掌握整个杀菌过程，完美的人机对话功能可使操作人员简易的完成操作。

4 完美记录：全自动灭菌技术采用了我们成熟的杀菌温度记录系统技术，控制系统通过RS485通讯和电脑连接，系统可实时地显示整个杀菌控制过程，亦可将杀菌过程的温度压力曲线自动地存储到计算机中，用户可以随时查阅。也可以通过打印机随时打印，可实现工厂远程控制和远程数据管理。

文/风卷残云 整理

本作者主要出没于《发酵工程》代谢机理研究群、《发酵工程》大工艺6群