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农林牧渔-兽医学：非洲猪瘟的实验室诊断技术

本着接地气的原则，笔者尝试着对非洲猪瘟的实验室诊断技术，主要是荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附技术，展开分析讨论，供ASF防控参与者一同交流。商品化试剂盒常常做为技术的载体出现，这里不做任何厂家试剂盒的广告，仅从技术角度分析讨论。在讨论诊断技术之前，笔者提出ASF商品化试剂盒的选择原则。

1、试剂盒选择原则

01、敏感性比特异性更重要

去年8月3日沈阳非洲猪瘟疫情确诊之前，我国并不是ASF疫区，根除非洲猪瘟病毒的过程中，诊断技术敏感性与特异性不能兼顾的情况下，敏感性比特异性显得更加重要。用ELISA方法检测ASFV抗体时，间接ELISA较阻断ELISA的敏感性有优势。OIE官方建立的方法，也是间接ELISA（OIE Terrestrial Manual 2012;Chapter2.8.1）。有条件的话，可以采用间接ELISA筛选，阻断ELISA复核。

2、假阴性比假阳性危害更大

得到非洲猪瘟的实验室检测结果后，阳性结果必然一下子戳中神经，震撼不已，对于阳性结果必然会进行复核。倘若是假阳性，便是虚惊一场。反而阴性结果常常直接略过，不被重视，若此结果是假阴性，那后果将是灾难性的。

	真实阳性	真实阴性
检测阳性	√√√	×
检测阴性	×××	√

3、经过验证的商品化试剂盒才可信

qPCR和ELISA是非常成熟的技术，商品化试剂盒的方法建立难度不大，而用大量临床样品、田间样品和标准品对商品化试剂盒验证与质控的过程，能够体现出严谨的科学态度。国内首发非洲猪瘟疫情之前并非疫区，无法收集到阳性样品，自主研发的商品化试剂盒的验证存在现实困难。不过日前农业部公布的两批非瘟试剂盒应该经过了验证，实验室可以放心使用。重磅！肇庆大华农通过第二次非洲猪瘟现场快速检测试剂评价

2、荧光定量PCR

笔者认为选择经OIE参考室验证的商品化试剂盒用于ASF监测排查，尽快掌握国内ASF疫情，快速处置，对ASF根除是有利的。部分商品化试剂盒在欧非等传统ASF疫区普遍使用，产品成熟而可靠。

若采取统一“度量衡”，以便于全国检测结果数据的横向比对。采用OIE推荐的非洲猪瘟病毒扩增p72基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U），开展监测排查具有现实可行性。导致检测结果出现假阳性和假阴性结果的因素很多，假阳性的原因自查后会发现，而如何避免假阴性结果的出现，是在检测工作开始之前需要认真考虑的事情。qPCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量，除了引物以外，还需要提取试剂、预混液、对照试剂等。

笔者在这里提出几点建议：

1、提供有效的检测样品是前提

《非洲猪瘟现场排查手册》对样品的采集、包装与运输做出了详细说明，推荐使用“三重包装系统”，运送的样品必须附有做够的冷却材料（如冰袋），以防变质。确保送达实验室的待测样品是有效的，是开展检测工作的前提。实际基层采样工作中，低温保存和运输是存在现实困难的。在这一方面OIE参考实验室德国FLI实验室（Friedrich-Loeffler-Institute）做了很好的尝试，采用GenoTube拭子采样管做为采样工具，常温运输和保存送达实验室，开展qPCR核酸检测，ELISA和胶体金检测卡抗体检测。更欣喜的是FLI对非洲猪瘟的样品采集进行了验证。

2、建立更严谨而合理的检测体系 设立内部阳性对照（IPC） 有效预防假阴性结果出现

国内兽医实验室qPCR检测中会设立阴性对照和外部阳性对照，但却很少设立内部阳性对照（IPC）。Xeno IPC其实就是与所有物种基因组无交叉的核酸序列，被检测样品结果阴性，Xeno IPC检测结果阳性（Ct值预期范围是已知），有效证明无qPCR抑制剂存在，从而降低了假阴性结果的风险，对ASF这类重大动物疫病监测具有重要的意义。美国兽医实验诊断协会（AAVLD）在实验室指南中明确推荐Xeno IPC在qPCR检测过程中使用。

3、选择高品质的核酸提取试剂和预混液

PCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量。核酸提取试剂盒必须是通用型样品制备试剂盒，可满足实验室对多种样品类型检测需求，并对全血、脾脏、淋巴结、扁桃体和环境样品等进行过验证。模块化技术经过专门优化，能够从最广泛的样品类型之中纯化核酸，具有高简便性、性能一致性并节省时间和成本，从而帮助提高实验室的效率。预混液要求对酶进行优化，以帮助鉴定那些最重要的动物病原体靶标，严格开发的试剂稳定且一致，即使用于最具挑战性的动物样品，在PCR抑制剂存在的条件下也依然有效。简单易用的预混液都能帮助获得值得信赖的结果。

4、环境样品的检测结果反应生物安全防护措施是否得当

做好生物安全防护措施才能有效预防非洲猪瘟的传入已成为共识，问题来了，如何证明生物安全防护措施是否得当？构建完善的生物安全监控网络，有计划的采集动物体和环境样品进行qPCR检测，通过客观数据足以量化生物安全措施的防护程度。尤其是针对猪场交叉区域的出猪台、卖猪车、无害化处理车、员工澡堂地面等区域环境样品的检测。

3、ELISA检测技术

在《我国首例非洲猪瘟的确诊》（王清华等）中指出，在非洲猪瘟确诊的辽宁省沈阳市沈北区采集的2头病死猪及同群30头临床健康猪血清，“对32份血清样品的ASFV特异性抗体检测结果均为阴性。” 通常感染了强毒力ASFV的猪只不产生抗体，感染了低致病力或非致死性毒株的猪产生高水平的抗体。急性或最急性死亡，病死率几乎100%是目前我国流行的非洲猪瘟疫情的显著特点，感染猪只未产生ASFV抗体已经死亡，因此很多人认为在当前疫情的情况下，开展血清学抗体检测是无意义的，在此笔者尝试着推敲当前疫情下ASFV抗体检测意义。

笔者认为ELISA抗体检测存在以下意义：

1、急性死亡的病例中也可以检出抗体

《OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册》强调：“在呈地方性流行或由低毒力毒株引起的初次爆发的地方，对于新暴发病的调查研究应包括应用ELISA检测血清或组织提取物中的特异性抗体；血清学方法在辅助确定ASF暴发时的作用不可低估，因为在急性死亡的病例中也可以检出抗体。”

2、及时发现新传入毒株或弱毒株 全面揭示ASF疫情状况

我国首例确诊非洲猪瘟病毒株为格鲁吉亚毒株（Georgia 2007），病死率100%，应该属于强毒力毒株。但同时该毒株从东欧传入俄罗斯，又传入远东地区传入中国，相比较而已，弱毒力毒株具有一定的隐蔽性，更有利于其长距离的传播。从这一点上来看，传入我国的ASFV格鲁吉亚毒株可能也具备一定的隐蔽性。另外，已经明确了23种基因型（Boshoof等，2007），报道的来自不同区域的毒株超过58株。其他基因型或毒株并不会静候在国门之外，强弱毒株都有出入的风险存在。

3、及时发现非洲猪瘟病毒变异后引起的猪场感染

1921年非洲猪瘟在肯尼亚第一次报道，家猪的死亡率为100%（Montgomery,1921）。2010年从不同地区和宿主（家猪、疣猪、扁虱）上分离得到的11株非洲和欧洲ASFV分离株，毒力大小各不相同，在基因组水平也呈现显著的遗传差异（De Villlier等，2010）。我国养猪过程中疫苗免疫种类多大剂量，猪体内抗体种类多，存在其他疫病抗体与ASFV交叉反应，以及干扰素等非特异性免疫应答的可能性，这可能导致ASFV感染猪病程增长，甚至产生抗体。若ASF在国内出现大规模流行，也可能出现病毒驯化的情况。较qPCR的抗原检测，ELISA抗体检测能够帮助猪场及时发现非洲猪瘟病毒变异后的感染。

4、及时发现隐性带毒动物

家猪和野猪都是ASFV等天然宿主，其中有三种非洲野猪可以隐性带毒，成为病毒储存器，这三种野猪是疣猪（Phacochoerus aethiopicus）、大林猪（Hylochoerus meinertzhageni）和非洲野猪（Potamochoerus porcus）（De Tray，1957）。我国除了野猪，还有众多的地方猪品种，很有可能存在众多对来势汹汹的ASFV不当回事，隐性带毒的动物存在。这一问题如果不能及时发现，后患无穷。

综上所述，我认为ASFV抗体检测的意义在于：抗体阳性结果具有明确的诊断意义，抗体阴性结果不能说明任何问题，需正确看待。抗体检测在当前会为我们揭示更全面的ASF疫情，在ASF根除过程中帮助我们及时发现疫情的变化。

目前进口的商品化ELISA抗体检测试剂盒并不多，以下品牌的ELISA试剂盒都经欧盟非洲猪瘟参考实验室（同时也是OIE和FAO非洲猪瘟参考实验室）西班牙CISA-INIA实验室验证，可以查询对应的验证结果，可网上自行查询选择。

制造商	技术类型	包被抗原
立陶宛 LT Biotech	间接ELISA	p22
法国 IDVET	间接ELISA	重组蛋白
瑞典 SVANOVA	间接ELISA	p30
西班牙 INGENASA	阻断ELISA	p72

CISA-INIA指出，在ASF呈地方流行的区域，确诊可疑病例最好用标准的血清学试验（ELISA），结合另一种血清学试验（IFA）或抗原检测试验（FAT）。在有些国家，95%以上的阳性病例用IFA和FAT结合方法鉴定。IFA和FAT技术目前在国内兽医实验室普及度很低，建议多结合qPCR核酸检测结果诊断。（资料来源：兽医兽诊断试剂）