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医疗化学检验：代谢组样品收集方案
代谢组学研究的样本主要是尿液、血浆或血清、唾液，以及细胞和组织的提取液等。由于代谢谱容易受到众多因素的影响，收集代谢组学研究的样本需要根据实验设计，样本特征进行严格的控制，考虑收集的时间、样本的保存条件和保存时间等的平行性。特别是临床生物样本不易控制，要考虑受试患者和健康对照人群之间的年龄、性别、饮食状况、作息习惯、体重、用药情况等因素的匹配。这些因素的改变均可导致代谢谱的变化，影响实验结果。
特别注意，样本采集时需要第一时间使用萃灭：快速使组织或细胞内的酶失活，防止代谢物的变化。液氮速冻是常用的萃灭方式。下面给大家详细介绍一下各类型样品的收集方法：
一、血清、血浆样本收集
1.血清与血浆相比，血清不含纤维蛋白原。
2.血清中代谢物的含量略高于血浆，血清和血浆均可用于代谢组学研究，但是取样尽量一致，要么都用血清，要么都用血浆。
1. 血清
1.1 样品量要求
NMR实验500μL/样本；GC-MS，LC-MS实验200μL/样本，避免反复冻融。
1.2 样本收集步骤
1）血液收集在离心管中37°C(或室温)静置30min或1h进行凝固分层；
2）3000rpm室温离心10min，待血细胞完全沉降到管底后，取上清转至干净的离心管中；
3）再12000rpm4°C离心10min，取上清分装到1.5mL离心管中，每管 0.2mL，-80°C冻存，干冰寄送。
1.3 注意事项
1）取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样；
2）取血时如用麻醉剂，建议用异氟醚，防止在NMR血清谱图中出现干扰峰；
3）血清参考产率≈30%-50%，例如1mL全血大约能得 0.3-0.5mL血清；
4）采全血时如使用真空采血管，请务必使用无预加抗凝剂的凝血管；
5）建议尽量多的收集样本并分装冻存，且避免反复冻融。
2. 血浆
2.1 样品量要求
NMR 实验500μL/样本；GC-MS，LC-MS 实验200μL/样本，避免反复冻融。
2.2 样本收集步骤
应使用肝素钠抗凝管采集全血，并尽快进行血浆分离：3000rpm室温离心10min，待血细胞完全沉降到管底后，取上层，0.2mL/管分装至1.5mL离心管中。-80°C冻存，干冰寄送。
2.3 注意事项
1）取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样。
2）对于抗凝管的选择：代谢组学实验检测推荐使用肝素钠抗凝管（因为柠檬酸是TCA循环中的重要物质，使用柠檬酸钠抗凝剂会引入外源污染；EDTA 会影响NMR采谱）。但肝素钠会对RNA相关实验有负面作用。
3）最后分装保存推荐使用1.5mL冻存管，因为螺口冻存管管帽内有一个橡胶垫圈，目的是为了密封。
4）血浆参考产率≈50%，例如1mL全血大约能得0.5mL血浆。
二、尿液、唾液、瘤胃液、脑脊液样本收集
1. 尿液
1.样品量要求
1mL/例。
2.样本收集步骤
收集尿液的前一天饮食要清淡。晨起中段尿（临床）或晨间1h 尿（动物），4℃10000rpm 离心10min，取上清，用1.5mL 离心管分装保存，每管1mL，-80℃冰箱冻存。最好保存两管，以保证两次实验的量，足量干冰寄送。
3. 注意事项
动物1h尿量不够，可分多次收集，若要收取24h尿液，请使用带有低温装置的代谢笼收取，及时冻存。
2.唾液
1. 样品量要求
0.5mL/例。
2. 样本收集步骤
禁食禁烟禁酒2h以上，上午9:30-11:30 取样，蒸馏水漱口，将唾液外吐于无菌痰杯内（保持冰浴），不要咳痰，收集5-10min，4℃10000rpm，离心10min，取上清，再经0.22μm滤膜过滤除菌，500μL分装，保存于-80℃。
3. 瘤胃液
1.样品量要求
1mL/例，建议多取一些。
2.收集步骤
瘤胃液经6000g离心15min，取上清，1mL分装，-80℃冻存，干冰寄送。
4.脑脊液
1. 样品量要求
200μL/例。
2. 收集步骤
取样后，4℃10000rpm离心10min，取上清，200μL分装保存。保存于-80℃，干冰寄送。
三、细胞样本收集
适用细胞类型：哺乳动物细胞系
1. 样品量要求
1×10*7 cell/样本，提供2份样本。
2. 样本收集步骤
悬浮细胞：
1） 连同培养基转移到15mL的离心管（进口）中。
2） 1000g离心10min收集细胞（1×10*7 个细胞为宜），弃上清。
3） 用预冷的 PBS 小心重新清洗沉淀一次，1000g离心10min收集细胞，弃上清。
4） 再用PBS重悬并离心一次，倒掉PBS （尽量倒干净），将离心管的尖端插入液氮中，萃灭细胞沉淀1min。-80°C冻存，干冰寄送。
注意事项：
1) 请先拿空离心管的尖端插入液氮中试试离心管的质量，如果不破则没问题，如果插入液氮中就破了，那么就省掉萃灭这一步。
2) 操作尽量迅速，培养基尽量倒干净，如有滤纸，可以用滤纸条将底部残留的培养基吸尽。
贴壁细胞：
1） 弃培养液，并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液。
2） 加入4℃预冷的PBS（若用移液枪加，则靠着培养皿壁加入，以免将细胞冲起），平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞，然后弃PBS，重复以上操作两次以洗去培养液。
3） 将培养皿置于冰上，向培养皿内加入4℃预冷的500μL预冷的甲醇-水（4：1，V/V），用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），冰上斜置培养皿，使得缓冲液流向一侧，用移液枪吸取细胞溶液至预冷的离心管内。
4） 再向培养皿中加入500μL甲醇-水（4：1，V/V），将剩余的细胞尽量全部转移至离心管中，1000g离心10min 收集细胞，弃上清；液氮速冻萃灭，保存于-80 ℃，干冰寄送。
注意事项：需使用色谱纯的甲醇以及双蒸馏水。
四 、动物组织类样本收集
适用于心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、肌肉等。
1. 样品量要求
GC-MS，LC-MS实验200mg/样本。
2.样本收集步骤
1）如果组织上有血，用生理盐水漂洗掉。
2）根据具体实验设计取特定的部位，200mg/样本装入离心管中。
3）标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15min，-80°C冻存；干冰寄送。
五、粪便、肠道内容物样本收集
1.样品量要求
200mg/样本，避免反复冻融。
2.样本收集步骤
收集到新鲜粪便或肠道内容物样本后，分装样本200mg/管，建议分装 15~20 管备用，立即用液氮速冻处理15min，-80°C 冻存，干冰寄送。
3.注意事项
由于粪便/肠道内容物中有非常多微生物，其代谢速度很快，反复冻融会对代谢水平有很大影响。建议样本收集后，按照200mg/样本进行分装冻存。
六、植物类样本收集
1.叶 片、茎、花
1.1 样品量要求
GC-MS，LC-MS 实验200mg/样本。
1.2 样本收集步骤
取整片叶片/一段茎/一朵花，用锡箔纸包裹并标记后，迅速放入液氮中冷冻处理至少15min。取出后迅速放入自封袋中(每组一袋)，在自封袋中放入标签纸注明样本信息。迅速放入-80°C冻存，干冰寄送。
1.3 注意事项
1）采集叶片样本时，最好在中午光照好的时间收集。
2）要根据实验设计，采集样本时保持样本一致性，尤其是同一组样本（如颜色、衰老程度、叶脉占比、光照、位置等）。
2. 根
2.1样品量要求
GC-MS，LC-MS 实验500mg/样本。
2.2样本收集步骤
1）取整株植物的根部，迅速用1*PBS漂洗掉根上的泥土。
2）根据具体实验设计取植株根特定的部位，500mg/样本装入离心管中。
3）标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15min。-80°C冻存，干冰寄送。
2.3注意事项
1）PBS漂洗要快。
2）由于根部组织特别脆弱，被挤压后会变成浆糊状，所以推荐保存至离心管中，而不是锡箔纸包裹。
3.果实、种子
3.1样品量要求
GC-MS，LC-MS 实验200~500mg/样本。
3.2样本收集步骤
1）对于含多汁、块头较大的果实（番茄、西瓜、苹果等）需要先用锋利的刀分割成“均匀”合适的小块(≈200mg/样本)分装至2mL离心管中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理。
2）对于细小的颗粒种子(拟南芥种子、谷物种子等)，可以先将同一组的植株种子混匀后再分装(≈200mg/样本)至离心管中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理。
3）对于要求对整个果实进行提取的（整粒葡萄等），需要把果实装在50mL 离心管中/自封袋中，标号后迅速放入液氮中冷冻处理。
3.3注意事项
1）对多汁的果实进行取样很难保持均一性(如番茄、皮、果肉、果瓤、籽的占比)，建议将整个果实进行研磨、冻干，对粉末进行称重分装。
2）不推荐用锡箔纸包裹。
七、微生物样本收集
适用样本：大肠杆菌、枯草杆菌、酿酒酵母菌、恶臭假单胞菌、酵母、棒杆菌属、单胞藻、运动发酵单胞菌、氧化葡萄糖酸杆菌等。
1.菌体数量
需要菌体的数量为：1×10*8（一次实验的用量）。一般OD600≈0.6 时，细菌处于生长指数，其浓度为10*8cell/mL。此标准为经验值，需根据自己实验室具体情况进行调整。
2.取样步骤
1） 将 1~2 mL菌液转移到离心管（进口）中。
2） 1000g离心10min收集菌体（1×10*8 个细胞为宜），弃上清。
3） 用预冷的PBS小心重新清洗沉淀一次，4°C1000g离心10min收集菌体，弃上清。
4） 再用PBS重悬并离心一次，倒掉PBS（尽量倒干净），将离心管的尖端插入液氮中，萃灭细胞沉淀1min。-80°C 冻存，干冰寄送。
3. 注意事项
1）请先拿空离心管的尖端插入液氮中试试离心管的质量，如果不破则没问题。
2）微生物代谢速度非常快，所有的步骤需尽快完成。
3）菌体数量不同样本间需要保持一致；
4）OD值供参考，需要根据具体情况确认。
4.微生物培养液（研究胞外代谢）取样步骤
方法一：培养好的菌液混匀后，取10mL菌液，用0.2μm 孔径的过滤膜进行快速抽滤，去除菌体。将滤液按1mL/well 进行分装，‐80°C 冻存，干冰寄送。
方法二：培养好的菌液混匀后，取1mL 菌液，3000rpm，4°C 离心10min，取上清800μL，‐80°C 冻存，干冰寄送。