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猪场检疫非洲猪瘟PCR荧光定量样品采集的严格要求

一个完整的非洲猪瘟病原荧光定量PCR检测流程一般包括：样品采集及保存；样品前处理；核酸提取与配液；上机扩增；检测结果导出及分析等。

从实验流程来看

样本的正确采集及运输是保证实验室检测结果的首要因素。

采集什么样品？多少数量合适？怎么规范采集？采集后该怎么处理？如果不进行及时检测，又该怎么保存样品？检测完的样本又该怎么处理？

以检测非洲猪瘟病毒为例，参考FAO《非洲猪瘟-发现与诊断》中文版如进行非洲猪瘟病毒检测，病原学样品包括：

1. 抗凝血（全血）：

采集：使用含有抗凝剂（EDTA-紫色盖）的无菌管（真空采血管）从颈静脉、下腔静脉或耳缘静脉抽取全血5ml。如果动物已经死亡，可以从心脏中采血，但必须立即进行。冷藏运输，到达检测实验室后，可选择-70℃冷冻保存。

注意：不能使用肝素（绿色盖子）的无菌采血管，会抑制PCR反应，易造成假阴性。

2. 血清：

采集：使用未加抗凝剂的真空采血管从颈静脉、下腔静脉、耳缘静脉，或剖检过程收集5ml血液样品，建议先在4℃放置14-18小时分离血凝块，丢弃凝固物，并离心10-15分钟，回收澄清的上清液（血清），血清样品在分离后可以立即开展检测，也可冷藏运输，到达实验室后，可选择-70℃冷冻保存。

注意：如血清是红色，已经发生溶血，不能用于ELISA检测。

3.器官和组织样品

采集：目标器官是脾脏、淋巴结、扁桃体、肾脏等，其中脾脏和淋巴结通常病毒含量最高，冷藏运输，尽快提交给实验室，如无法及时送检，可将样品储存在冷库或液氮中。可用10%缓冲福尔马林浸泡30分钟以上进行病毒的灭活之后再进行PCR的检测。

注意：如猪场发现疑似非洲猪瘟症状，为避免污染场内环境和人员，请勿在猪场内剖检，尽量求助实验室，根据相关实验数据表明，病死猪每克组织中含PLD50病毒含量达10万以上。

4.软蜱

采集：收集软蜱，尽量让蜱存活以确保蜱内病毒的保存完好，并避免DNA降解。可将收集的钝缘软蜱放入有螺旋盖的样品瓶/管中，放入少量土壤，盖内衬以纱布，常温保存运输。到达检测实验室后，-70℃ 冷冻保存或置于液氮中；如仅对样品进行形态学观察，可以放入100%酒精中保存。

注意：其余如蚊蝇等昆虫同样如此，尽量使其存活送检，或者直接储存在液氮中。

5.环境样品

采集：可多采集环境拭子，如粪便，泔水，饲料等，4℃保存。

6、唾液样品

除上诉非洲猪瘟疫情应急实施方案（2019年版）中提到的相关病原学样品外，根据非洲猪瘟的同居感染实验结果显示，非洲猪瘟自然感染情况下病毒最早出现在唾液中，因此建议在无症状猪群定期排查时使用唾液作为检测对象。

采集：采集唾液前尽量对猪群实行停料不停水，可选择控食过夜，在第二天进食前采集唾液，保证唾液里面没有食物残渣，确保唾液样本质量不会影响检测结果，同时采集到的唾液如果1小时内不能做核酸提取就需要马上冷冻。

为了获得正确的诊断，必须在适当的温度下，以最快的速度正确采集样品，仔细进行包装保存、做好标记，尽快到达检测实验室，运输的样品必须有足够数量的冷却材料，例如冰袋，以防止变质。

实验室工作是特别需要样本支撑的！如果样品状况不佳，后续工作可以不用开展，因为无法做出准确的诊断。

笔者言：对于高效、科研机构、动检动监、屠宰企业、集团化企业，有专业的实验室、专业的人员、专业的素质用PCR做检测是最科学准确的。PCR设备并不适合现场使用，主要是环境中可能会存在的污染，非常容易导致“假阳性”，给诊断带来不必要的误导。

对于家庭农场和中小猪场而言，针对正在发病的猪和刚刚死亡的猪，使用非洲猪瘟抗原免疫层析快件卡是一个合适的选择，病毒载量大诊断率更高更合理。

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